在线分享双特异性抗体的下游工艺开发挑战

前言

鉴于双抗分子的复杂性，在双抗生产过程中会产生大量的副产物，如同源或异源二聚体、半抗、抗体片段、轻链聚集体、重链聚集体等。为了减轻后续的纯化压力，除了理性的分子设计之外，纯化工艺的选择也是非常关键的环节。

亲和层析

双抗往往在分子设计之初就会考虑后续的纯化方法。在所有的纯化技术中，一步亲和层析往往可以达到多步其他层析方法无法达到的纯化效果。

在单克隆抗体的（mAb）纯化工艺中，常采用ProteinA亲和层析捕获产品。与mAb纯化工艺一样，BsAb纯化中ProteinA亲和层析中也是最常用的亲和纯化方法之一，该方法通过ProteinA和目标BsAb分子的Fc区域及VH3基因家族的重链（HC）可变区（VH）之间的相互作用进行纯化。

图1.赛默飞抗体亲和层析产品结合位点

第一种亲和层析填料：

以ProteinA配基为基础的填料有MabCaptureAselect和MabCaptureC两种，MabCaptureC是MabCaptureAselect的升级版。它的结合特征如下：

对抗体的结合位点位于CH2和CH3结构域之间的连接处，以及抗体Fab区VH3的特定位点。

能够结合IgG1、IgG2和IgG4的Fc区，而与IgG3无相互作用。

第二种亲和层析填料：

以VHH为基础的配基来源于美洲羊驼免疫球蛋白中的重链可变区（VHH），为12-15KDa的多肽，针对轻链或重链上的不同人源化抗体亚结构域。可以高特异性识别和结合人源IgG，而不结合其他来源的IgG。配基在酵母体系中表达，安全无动物源，并具备法规支持文件，可用于临床及工业化生产。

这些填料可以作为亲和纯化平台用于各种抗体形式，此类填料包括：CH1-XL亲和基质、FcXP亲和基质、KappaXP亲和基质、LambdaXP亲和基质。

接下来，我们来详细看一下ThermoFisherScientific在双抗亲和纯化中可以提供的解决方案。

01

IgG-like双抗的亲和纯化

可以选择IgG-CH1/CH1-XL或者MabCaptureA/Cselect或FcXL/FcXP进行亲和捕获，去除双抗中的同源二聚体、半抗、轻链相关杂质和聚集体等产品相关杂质。IgG-CH1/CH1-XL结合抗体的CH1区域，MabCaptureA/Cselect结合抗体的CH2-CH3界面和VH3区域，FcXL/FcXP结合抗体的CH3区域。用KappaXL/XP或LambdaXP去除重链相关杂质，二者分别特异性地结合κ和λ型轻链的恒定区。

以proteinA配基为基础的层析产品往往是纯化IgG-like抗体的首选。MabCaptureC为MabCaptureAselect的升级版，该填料配基基于proteinA，因此可结合CH2-CH3界面和VH3。

跟上一代产品相比主要优势如下：

高载量：保留时间4.8min时单抗结合载量55g/L

配基碱稳定性：0.2MNaOH条件下cycles

在保留时间为4.8min时，MabCaptureC的动态载量为55g/L（图2，左图）；且随着保留时间的延长，动态载量会持续增加，在保留时间6分钟时，动态载量可达60g/L（图2,右图）。

图2.MabCaptureC动态载量及载量

随保留时间的变化

除了载量相较于上一代产品有了较大的提高之外，MabCaptureC有着出色的耐碱性：用0.2M氢氧化钠清洗个循环后，动态载量基本没有下降（图3.左图）。HCP等杂质的去除率也依然保持着较高的水平，用0.2MNaOH清洁个循环后对HCP的去除率仍然保持在1.5个log降水平（图3,右图）。

图3.MabCaptureC耐碱性及HCP去除率

鉴于双抗分子的复杂性，并不是所有IgG-like的双抗用proteinA纯化都可以取得好的结果。此时，可以选择用CH1-XL或FcXP等进行亲和纯化，且CH1已经有用于双抗纯化的成功案例。

应用案例：用CH1去除CD3-TAA双抗中的杂质

此案例中，目的双抗和产品相关杂质如图4所示：

图4.CD3-TAA双抗和可能的副产物

CaptureSelect?CH1-XL亲和层析介质是ThermoFisherScientific推出的一款专门用于纯化人源IgG(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4)和Fab片段的亲和填料，该填料以琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法将可以特异识别抗体重链CH1区域的配基偶联在基架上，填料平均粒径65μm，动态结合载量大于15g/L。

在本应用案例中，通过KiH分子设计，将TAA过表达，从而减少CD3同源二聚体生成。然后使用CaptureSelect?CH1-XL亲和层析介质，可以一步去除TAA同源二聚体、半抗、轻链和聚集体。而且在50mMaceticacid，10%glycerol和10%的Sucrose，pH4.0条件下洗脱，条件比较温和，减少了聚集体的产生。经CH1纯化后，抗体单体含量达98%，聚集体含量不足2%（图5）。

图5.用CaptureSelect?CH1-XL亲和层析介质纯化CD3-TAA双抗

（SDS-PAGE图中泳道1-3代表用proteinA纯化双抗的初始样品、流穿和洗脱；4-6分别代表用CH1XL纯化双抗的初始样品、流穿、洗脱）

02

非IgGlike双抗的亲和纯化

非IgG-like的双抗，亲和阶段可采用IgG-CH1CH1-XL、KappaXL/XP或LambdaXP、MabcaptureC进行亲和捕获。

IgG-CH1/CH1-XL结合抗体的CH1区域，MabCaptureA/Cselect结合抗体的VH区域，KappaXL/XP或LambdaXP分别特异性地结合κ型和λ型轻链的恒定区。

对于κ和λ两种不同的LC共表达的BisAb，可以采用顺序亲和层析有效提高纯化效率，即：首先以CaptureSelectIgG-CH1亲和树脂捕获抗体，使污染物和游离LC流穿；然后采用KappaXP亲和树脂去除仅含λLC的抗体；最后，以LambdaXP亲和树脂去除仅含κLC的抗体。这种连续亲和层析法也可用于纯化单结构域Ab片段如VHH。

综上所述，双抗亲和层析阶段赛默飞可以提供的主要产品（每个结合位点仅列出了最新一代产品）及参数如下：

表1.赛默飞抗体亲和层析产品

03

客户定制抗体亲和层析

除了以上商业化的亲和填料之外，赛默飞可以基于客户的分子类型，设计和开发基于美洲羊驼单域抗体VHH的定制配基。

VHH结构域是最小的功能完整的抗原结合片段，源自全功能抗体（图6）。VHH区域的三个高度可变的互补决定区（CDR）决定配基的亲和特异性。定制化的配基也将由重组酵母表达，不含动物源性成分，可用于商业化生产。

图6.常规IgG抗体与骆驼单域Ig抗体和VHH抗体片段的对比；最右侧的图像显示的是VHH与其靶蛋白结合

离子交换层析

离子交换层析是双抗纯化中应用非常广泛的层析技术，该技术基于不同分子之间带电种类和数量的差异进行样品和杂质的分离。该层析技术可用于二硫键错配相关杂质和BisAb片段的去除，比如同源二聚体、等电点改造的双抗、半抗、3/4抗体、重链恒定区、轻链恒定区（单体或二聚体）等。

赛默飞的离子交换产品全部采用POROS基架。

聚苯乙烯-二聚乙烯苯基础结构使Poros填料具有稳定的物理化学性质，坚硬，不可压缩。

独特的灌注层析技术使Poros填料具有独特的大流穿孔结构，具备高载量。

Poros填料平均粒径50um，一方面提供了卓越的分辨率，另一方面也易于在商业化生产中进行放大。

ScFv主要的挑战是稳定性，Poros填料流速大，可以快速纯化，保证纯化的速度，减少不稳定性。

图7.POROS填料结构

目前用于抗体纯化的离子交换填料主要有5中，其中有三款阴离子交换填料：HQ50，XQ，D50；两款阳离子交换填料:HS50和XS。这些填料的基本信息如下：

HQ50和XQ是强阴离子交换填料，HQ50是上一代的强阴离子交换产品，广泛应用在单抗精纯的流穿模式中。XQ是最新一代强阴离子交换产品，与HQ50相比不但在载量上有了翻倍的提高，同时增强了耐盐性。

综合性能的提高使其在抗体和重组蛋白的纯化中都有了更好的表现，在双抗的纯化中也有着出色的表现。D50属于弱阴离子交换填料，相当于传统的DEAE。

POROSHS和XS属于强阳离子交换填料，是现在抗体纯化工艺中应用最多的阳离子交换填料。50微米的粒径提供了超高的分辨率，XS同时具有超过毫克的载量和最好的耐盐性。

表2.ThermoFisherPOROS离子交换填料种类及基本特性

总体来说，在强离子交换介质中，XS和XQ具备更好的耐盐性，而且载量均在mg/ml以上，远远高于HS50和HQ50。

疏水层析

疏水层析是根据蛋白表面疏水性的差异对物质进行分离的一种层析方式。

在高盐环境下，蛋白的疏水基团暴露在表面。在熵增驱动下，蛋白的疏水区域与填料的疏水配基结合。疏水性越强的样品，与疏水配基的结合越强，越晚洗脱。疏水层析可用于双抗生产过程中多种产品相关杂质的去除，比如同源二聚体、半抗、3/4抗体、重链恒定区、轻链恒定区（单体或二聚体）、聚集体等。

赛默飞的疏水层析产品全部采用POROS基架，因此具备POROS基架的所有优点：如高流速，大孔径，易于放大等。跟市面上其他疏水层析产品相比，Thermo的疏水层析产品分别有疏水性最弱的Ethyl和疏水性最强的Benzyl、BenzylUltra。这三款疏水填料的应用可基于不同的蛋白分子纯化需求，应用不同盐浓度的缓冲液。POROS?BenzylUltra填料疏水性最强，专门设计于在低盐条件下的应用，该填料在流穿模式下依然保持良好的性能。

图8.赛默飞疏水层析产品

总结

赛默飞在抗体纯化方面丰富多样的产品，为双抗的纯化提供了丰富的思路。

亲和层析产品主要分为proteinA配基和VHH单域抗体配基两大类：以ProteinA配基为基础的产品有MabCaptureAselect和MabCaptureC；以VHH为基础的配基有以下产品：IgG-CH1/CH1-XL，FcXL/FcXP，KappaXL/XP和LambdaXP。

亲和层析之后，往往需要经过离子或疏水层析进一步纯化。ThermoFisherScientific在双抗纯化过程中可以提供的离子交换产品有强阳离子交换填料HS50和XS，强阴离子交换填料HQ50和XQ，弱阴离子交换产品D50。疏水层析产品有弱疏水介质Ethyl和强疏水介质Benzyl、BenzylUltra。

有以上产品保驾护航，可以提供如下双抗纯化思路：

图9.赛默飞双抗纯化路线

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参考文献

StevenM.Chamow,PayalP.Pratap,AngelaL.Linderholm,KatherineE.Harris,UteSchellenberger,andBrettJorgensen.CaptureofCH1-ContainingBispecificAntibodies.BioProcessInternational,18(5),May.

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